角膜内皮细胞相关基础及临床研究的现状

　

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角膜内皮细胞(HCECs)是保证角膜透明的重要结构，在角膜后弹力层和前房之间，具有屏障和离子泵功能，防止前房房水进入角膜的同时又可以将角膜基质中的水分转移至前房，维持角膜正常厚度。当HCECs损伤、密度下降到一定程度时，这种平衡被打破，就会产生角膜水肿等角膜疾病。因此，HCECs在角膜组织解剖中的作用十分重要。此外，目前在体HCECs是不可再生的，一旦损害，视力将会严重受损。本文中笔者就HCECs的正常生理、损伤机制、检测、治疗及再生的研究情况进行综述。

角膜内皮细胞;损伤机制;检测;治疗;再生

角膜内皮细胞(humancornealendothelialcells，HCECs)是角膜中决定清晰视力的最重要结构，一旦角膜内皮受损至一定程度，导致HCECs失代偿，就只能依靠手术治疗。近年来，随着国内外研究者对角膜内皮细胞的不断深入研究，有研究者试图使HCECs在体内再次进入有丝分裂循环周期，使其再生，从而从根本上解决HCECs失代偿问题。本文中笔者总结近年来相关研究的成果，对HCECs的生理结构、损伤机制、相关疾病、致病因素、检测、标记、染色方法、治疗现状及细胞再生的研究情况进行综述。一、HCECs的正常生理状态人眼角膜是一种高度透明的组织结构，从外到内有五层，分别是上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮细胞层［1］。HCECs是角膜的最内层，为单层细胞结构，具有离子泵功能，与前房房水直接接触，在保持角膜透明方面起着重要作用［2］。HCECs是由胚胎时期神经嵴细胞的间充质细胞发育而来的，出生2个月婴儿的HCECs密度由个/mm2到1岁个/mm2，后随着角膜生长迅速下降，5岁时约为(±)个/mm2，10岁时约(±)个/mm2，然后再以每年0．6%的速度下降［3-6］。

二、角膜内皮损伤机制、相关疾病及致病因素

HCECs需保持在～个/mm2才能维持角膜的透明性和正常功能［7］。当疾病、年龄等因素造成HCECs损伤时，HCECs会失去其屏障功能和离子泵作用，引起角膜不可逆的水肿和混浊，造成患者不可逆的视力受损。由于HCECs不可再生，只能依靠临近细胞变大或者移行到达损伤区以维持屏障功能和离子泵作用。当HCECs损伤严重时，临近细胞的变大或者迁移不足以维持正常HCECs屏障功能和离子泵作用时，HCECs就会失代偿，产生严重的角膜水肿和大泡性角膜病变，使视力下降。全身性因素、角膜原发病、屈光因素、青光眼、炎症和外伤均可导致HCECs损伤［8］。全身性因素包括糖尿病、高血压、代谢综合征及慢性肾衰［9-13］;角膜原发病，包括Fuchs角膜内皮营养不良、Peters异常、虹膜角膜内皮综合征及圆锥角膜［14-18］。另外一些眼内手术，如白内障手术、穿透性角膜移植手术、青光眼手术等均会造成HCECs的损伤［19-21］。青光眼手术会对HCECs造成一些不可避免的损伤，甚至引起HCECs失代偿;玻璃体切除手术及硅油填充也可直接影响内皮细胞的形态［22-23］;穿透性角膜移植手术是能有效提高患者视力的手术，但如果植片制作不当，也会导致内皮细胞形态、密度及数量异常［24］。有报道碳酸酐酶抑制剂能够造成角膜中央厚度显著增加，其原因可能是抑制了HCECs的碳酸酐酶同工酶Ⅰ和Ⅱ，从而破坏了HCECs的离子泵功能，造成角膜水肿［25］。三、角膜内皮的检测、标记和染色方法

HCECs检测最常用的方法是非接触角膜内皮镜(图1A)和活体共聚焦显微镜(图1B)，可以评价角膜中央厚度、细胞面积的变异系数、平均细胞面积、六边形细胞比率以及HCECs的密度。角膜中央厚度可间接反应HCECs的功能［26-27]。活体共聚焦显微镜可以对角膜进行从前往后的细胞水平的扫描和显像，具有实时性、高分辨率的优点［28］。同时可以使用自带软件对HCECs进行密度计算。细胞面积的变异系数可作为HCECs早期改变的敏感指标，六边形细胞比率对内皮细胞损伤和不稳定敏感性较高，平均细胞面积和HCECs密度可用来表示HCECs的储备能力。另外眼反应分析仪、可视化生物力学分析仪、Pentacam三维眼前节分析仪、眼前节光学相干断层扫描仪、A超和超声生物显微镜等均可用来测量角膜厚度。

图1非接触角膜内皮镜成像及活体共聚焦显微镜成像：图A为角膜内皮镜对角膜内皮评估界面;图B为活体共聚焦显微镜显示角膜内皮细胞的大小、形态结构

Yoshihara等［29］确定了CLＲN1、MＲGPＲX3、HTＲ1D、GＲIP1和ZP4共5个基因作为HCECs的新标记，并通过独立实验在核糖核酸和蛋白水平上证实了这些基因的特异性。这些标记物可用于纯化实际的HCECs，也可用于评价其他细胞类型的产物。

内皮细胞可以用茜红素-S和台盼蓝进行离体组织染色［30-32］。操作时，沿角膜缘取下离体角膜，依次置于10%甲醛溶液15min、新鲜柠檬汁15min，蒸馏水冲洗3次，10%氯化金溶液15min、醋酸溶液(20℃)15～16h。取出角膜后，用齿镊撕掉内皮层和后弹力层，再用显微剪将角膜沿周边向中央呈放射状切开，显微镜下观察［33］。

四、角膜内皮疾病的治疗方法

(一)病因治疗

由全身性因素引起的HCECs失代偿，应积极治疗原发病，采取对症治疗方式。如因为高血压和糖尿病而查出内皮细胞失代偿，应积极控制血压和血糖;肾衰竭应以透析为主;因屈光因素导致HCECs异常的佩戴角膜接触镜，应尽量选择透氧性高的镜片;因炎症性疾病导致的HCECs失代偿，应及时使用抗生素类药物，必要时联合糖皮质激素和非甾体消炎药;因药物毒性引起HCECs损伤的，应尽早停药观察;眼科医师在白内障、青光眼以及眼内手术时，也应尽量避免损伤内皮细胞。

有研究者发现在白内障合并青光眼患者中，将丝裂霉素C应用于超声乳化联合小梁网切除术，可减少术后并发症，降低损伤HCECs的风险［34］。总之，角膜内皮疾病的患者，应仔细询问既往史，是否伴有全身其他疾病，或者当发现患者HCECs密度处于持续下降状态且其他治疗均无效时，应嘱患者去查全身相关其他疾病，排除全身因素造成的角膜内皮失代偿。(二)非手术治疗各种因素引起的角膜水肿，角膜厚度增厚，首选高渗脱水剂，上皮层不好的使用小牛血去蛋白提取物眼用凝胶等药物，促进上皮愈合，以及配合抗生素类药物预防感染。角膜绷带镜也可保护角膜不受眼睑摩擦损害，促进上皮愈合，减轻角膜水肿。当继发青光眼时，应当给予房水生成抑制剂，临床早期可以通过降低眼压来减轻角膜水肿，减轻HCECs负荷，对HCECs具有一定的保护作用。有报道称视紫红质蛋白激酶抑制剂Y可治疗Fuchs角膜内皮营养不良引起的角膜水肿［35］。(三)手术治疗手术是HCECs疾病最常见的治疗方式。因HCECs再生困难，一旦受损或者密度下降，将是不可逆转的，作为角膜与房水之间的沟通桥梁，一旦受损，HCECs离子泵功能受损，角膜透明度下降，角膜水肿，则会引起屈光不正、视力下降、视物模糊。穿透性角膜移植术是过去最常见的手术方式，现在角膜内皮移植术逐渐成为主流。角膜内皮移植术保留了角膜上皮层、前弹力层和基质层，仅去除病变的角膜内皮层和后弹力层，术后并发症少，排斥反应轻，该手术方式已取代传统的穿透性角膜移植术，具有恢复时间短、术后视力佳和免疫反应轻等优点［36］，并可在原基础上形成后弹力层撕除(自动)角膜内皮移植术［descemetstripping(automated)endothelialkeratoplasty，DS(A)EK］和后弹力层角膜内皮移植术(descemetmembraneendothelialkeratolasty，DMEK)。1．DSEK/DSAEK:该手术方式是撕除角膜后弹力层和内皮细胞层，受体角膜保留至后基质层。DSEK是植片保留少部分后基质层、后弹力层和内皮层;DSAEK是使用角膜板层刀制作植片的技术。后来又有研究者将飞秒激光与DESK联合，使切割精度大大地提高，植片厚度也可控，从而更安全有效，故称之为飞秒激光DSEK［37］。2．DMEK:DMEK与DSEK区别是植片的制备方式不同，DMEK只有角膜后弹力层和内皮层，不含角膜基质层，更符合角膜生理解剖功能，使植片与受体角膜在解剖结构上更加吻合，角膜后界面整齐，与DSEK相比大大节省了供体植片的体积，并且降低了免疫排斥发生率［38-40］。DMEK术后排斥率＜1%，远远小于DSEK，但其缺点是学习曲线较长，并且对植片的要求相对较高，故该手术方式的应用并不广泛［38］。(四)细胞治疗1．HCECs的体外培养和细胞前房注射治疗:HCECs在体内由于接触抑制和转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)的影响，不能进行有丝分裂，理论上将体外培养的HCECs注入前房能治疗因角膜内皮造成的角膜盲，但体外培养的HCECs仍存在内皮-间质转化(endothelialmesenchymaltransition，EMT)等问题，TGF-β阻滞、应用L-抗坏血酸-2-磷酸生长基、抑制基质金属蛋白酶活性等可以降低EMT［41］。有研究者向前房注射体外培养的HCECs，然后使患者保持俯卧姿势可治疗HCECs失代偿疾病，铁磁感应与Y可促进植片HCECs整合在受体HCECs中。但是，此方法的远期效果仍需进一步观察［41］。2．组织工程疗法:作为治疗角膜内皮疾病的一种替代疗法，该治疗方法包括种子细胞的筛选、载体选择和HCECs的移植。种子细胞要求能够分化单层HCECs，载体有壳聚糖和聚左旋乳酸等合成聚合物载体，也有明胶和角膜脱细胞材料等天然生物学载体。但是这两种载体均有利弊，聚合物载体纯度高、各种化学成分均已知，但易引起术后炎症反应;天然生物学载体中人脱细胞角膜基质材料是最佳选择，但缺点是供体有限。目前，已经有组织工程将DSEK植片成功植入动物眼角膜内皮层中［42］，但尚缺乏临床验证。五、角膜内皮再生的研究现状(一)离体HCECs再生研究HCECs的分离先后经历了机械刮削法、胰蛋白酶和中性蛋白酶法，但是由于这些方法容易引起EMT，使用的人越来越少，现在使用胶原酶分离HCECs已成为主流［43-47］。有研究表明，HCECs在体外具有有丝分裂能力，在体内并未退出细胞周期循环，但是细胞循环周期被抑制在G1期［48］。最早角膜内皮有丝分裂的证据是由Treffers发现的，两名患者角膜中央因低温造成损伤，随后进行了眼球摘除，该学者使用氚化胸苷发现了HCECs迁移和增殖的证据［49］。Joyce和Zhu也发现［50］尽管HCECs在体内处于非增殖状态，但它们仍具有再生能力，并可在体外继续增殖。已有研究者证实在兔子和猴子角膜内皮体外培养的培养基中加入Y能够保持HCECs的增殖能力，而可用于HCECs扩增的培养基有DMEM(dulbeccosmodifiedeaglemedium)、SHEM(supplementedepithelmedium)、HamsF12/M和OptiMEM-I(reducedSerumMediaisamodificationofeaglesminimumessentialmedia)［51-53］。与上皮细胞相似，TGF-β能有效抑制角膜上皮细胞增殖周期中G1/S的转变，另外TGF-β也是EMT重要信号分子［54-57］。Basu等［58］发现角膜缘生物组织衍生的基质细胞在含有人血清的培养基中迅速扩增，具有高度克隆性。该团队将体外培养的角膜缘生物组织衍生的基质细胞移植到小鼠角膜伤口时，角膜缘生物组织衍生的基质细胞有效阻止了含有纤维基质成分的光散射瘢痕组织的形成。角膜缘生物组织衍生的基质细胞的存在有效诱导了脱细胞间质再生，再生的组织表现为片状结构和胶原组织，且与原生组织无明显区别。周边和中央的HCECs有着不同的增殖能力，通过角膜内皮镜对正常角膜中央、旁中央和周边三个内皮层区域进行细胞形态学特点的比较，同时进行对角膜内皮进行密度测量，发现HCECs在角膜中央的密度最小，在周边的密度最大［59］。神经生长因子是一种促进神经细胞生长和营养神经元的调节因子，另有研究者发现神经生长因子可以在体外培养的HCECs再生和修复，同时，成纤维生长因子是一种多肽生长因子，也可促进细胞增殖［60］。有研究者发现使用TGF-β受体抑制剂和/或EMT抑制因子能够使HCECs在维持正常生理功能的情况下继续生长［57］。Palchesko等［61］研制了一种工程基底膜，它是由一层致密的Ⅳ型胶原和/或层粘连蛋白组成，厚度大约为nm，与Ⅰ型胶原膜连接，用此种工程基底膜设计一种HCECs，模拟具有薄基质层的后弹力层膜结构，用于板层角膜移植。另有研究发现乙二胺四乙酸和胶原Ⅳ能够解除细胞接触抑制，促使HCECs再次进入增殖期，更好地维持HCECs的存活、分裂能力并维持其特性［45，62-63］。然而，需要指出的是，HCECs体外培养技术虽已建立成功，但其体外细胞培养还存在增殖缓慢和不易保存等局限性，尚待解决。(二)在体动物角膜内皮再生研究早在20世纪60年代，Brunst等［64］就曾研究过六角龙鱼HCECs，该团队分别使用r、r、r、r、r及r的X射线对六角龙鱼角膜进行照射，照射距离15cm，结果显示，使用r照射后8d，角膜表面开始出现颗粒和色素细胞，15d后可见巨大的HCECs，17d后数量更多，18d后成圆形，角膜成片状，裂解，结构紊乱;使用r照射后18d，HCECs增大，21d后可见显著增大，23d后可见色素细胞，30d后可见颗粒状物质，HCECs紊乱，数量下降，大量色素颗粒;使用r照射后17d，角膜水肿增厚，HCECs增大，数量减少，21d后可见完全无序的HCECs，35dHCECs逐渐消失，在第38d和第42d发现消失的细胞被间质细胞替代;使用r照射17d后，HCECs被间质细胞替代;使用r照射27～28d后，角膜损伤达到最大，角膜不平整，HCECs肿胀且仍可见，后有两种不同结果，有些HCECs完全恢复，55d后完全正常，有些在照射62d后被间质细胞替代;使用r照射25d后，HCECs增厚，在第49d和第62d已能完全恢复正常。Bredow等［65］通过同种异体移植和同源移植两种方法研究了大鼠角膜内皮再生的情况，发现无论哪种移植，移植的HCECs都逐渐被宿主大鼠新生HCECs所重新填充。Schwartzkopff等［66］比较了Fisher和Lewis大鼠(Ｒ组)异体移植后HCECs对内皮细胞丢失后的免疫反应，以及Lewis大鼠(S组)同种异体移植后HCECs对内皮细胞丢失的免疫反应，结果发现Ｒ组发生了排斥反应，S组HCECs丢失导致中等不透明改变，但是在接下来的几周到几个月里，两组移植体的HCECs都恢复了清晰，并且在原来的无HCECs移植体上出现了一层新形成的内皮细胞层，其细胞不规则且增大。最后结论为大鼠在免疫或手术破坏HCECs后，可恢复移植物的清晰度，HCECs在大鼠角膜移植模型中再内皮化并进行增殖。Bostan等［32］选取了16只健康的猫进行研究。其中，8只右眼行角膜中央内皮刮除;4只注入体外培养密度为2×个/mm2的猫HCECs和Y;4只注入密度为1×个/mm2的猫HCECs和Y，并进行内皮标记;2只内皮全刮除，并注入标记过的密度为1×个/mm2的猫HCECs和Y;3只中央内皮刮除和3只内皮全刮除的只注入Y。结果发现中央内皮刮除的注入2×个/mm2的猫角膜透明度和厚度最好，最后得出结论，注入体外培养HCECs对内皮功能不全影响不大，只注入Y可使猫HCECs再生。Cornell等［67］研究牛HCECs在超顺磁性氧化铁纳米粒子磁场作用下的形态和生存能力的变化，发现当超顺磁性氧化铁纳米粒子浓度为×mol/L时，和无超顺磁性氧化铁纳米粒子相比，其代谢具有统计学差异，但是骨架差异不具有统计学意义。Okumura等［52］对7只食蟹猴角膜进行冷冻损伤内皮细胞，造成HCECs损伤动物模型，使用Y滴眼液，发现在形态和功能上Y能够有效促进内皮密度和内皮创伤的恢复。Kielbowicz等［68］实验选用25只10～12个月大的猫，依据观察时间分为五组，将角膜后弹力层和内皮层细胞角膜碎片置于Iscove培养基中，并加入10%胎牛血清，将经体外繁殖后细胞增殖的细胞注入到猫的前房，经30d后HCECs完全恢复。早在6年，Nakahori就发现兔HCECs具有增殖能力，也有人研究发现虽然绵羊HCECs在体内不能再生，但是细胞培养研究表明它能在水凝胶膜上再生，水凝胶膜是HCECs再生和移植的理想平台［69-70］。Chen等［30］发现，兔HCECs愈合有不同的结果而取决于有无Descemets膜，Descemets膜对兔HCECs损伤后的再生起着决定性作用。另外斑马鱼由于其有易于操作和显著的再生能力，且其角膜结构与角膜相似，具有相似的发育基因表达库，包括转化生长因子-β、角蛋白3和硫酸角蛋白，其突变与人类角膜营养不良有关。Heur等［71］使用30G针头将斑马鱼中央HCECs刮除约0．mm2，并注入哇巴因抑制Na+/K+酶活性，发现在1周后，斑马鱼内皮细胞恢复原来结构，后来该团队又用同样的方法破坏斑马鱼内皮层细胞0．mm2，不注入哇巴因，发现最早1d，斑马鱼HCECs层就恢复原有结构，最晚不超过15d。因此，得出结论，斑马鱼在内皮损伤1周后，就可重建内皮再生，恢复原有内皮层结构。Kim等［72］使用20G弯针刮除9只新西兰大白兔内皮细胞层直径约7mm的后弹力层和HCECs层，随机分为三组，一组为对照组;另一组植入体外培养的兔HCECs、0%天然芦荟凝胶和丝素蛋白透明薄膜支架，第三组植入体外培养的兔HCECs、3%天然芦荟凝胶和丝素蛋白透明薄膜支架。结果发现天然芦荟凝胶和丝素蛋白透明薄膜支架附着于角膜基质表面，并与周围角膜组织融合，HCECs恢复良好，证明天然芦荟凝胶和丝素蛋白透明薄膜支架有助于兔HCECs再生。(三)角膜内皮再生的临床研究有研究者在动物实验的基础上，且在患者知情并签署知情同意书的情况下，将Y滴眼液应用于8名角膜混浊或全混浊的HCECs功能障碍的患者，结果发现其能有效促进HCECs的愈合［52］。有研究者认为行后弹力层剥离术且无HCECs替代的患者，HCECs增殖可能是HCECs迁移和角膜基质深层自发重组的结果［73-74］。Pipparelli等［75］研究指出Y在体外和体内对HCECs均无毒性。Jullienne等［76］通过建立HCECs损伤的数学模型预测了内皮功能的变化。结果显示即使在长期HCECs损伤的85岁患者中，计算得到该患者HCECs密度理论上应有个/mm2。实际结果为该患者在第5、8、16和22个月HCECs密度分别为个/mm2、个/mm2、个/mm2和个/mm2，虽低于预测值，但是证明了HCECs有一定的自愈能力。此外，Soh等［77］还报道了首次成功用Descemet＇s膜移植治疗Fuchs角膜内皮营养不良的病例。综上所述，HCECs对于人眼至关重要，在维持角膜透明中起决定性作用。目前，对于HCECs疾病的治疗仍以手术为主，对HCECs损伤患者的早期发现、早期干预、降低HCECs损伤还未获得充分的重视。当前，角膜内皮移植手术已成为治疗HCECs失代偿的主要术式。值得指出的是，虽然已证明HCECs在体外具有可再生能力，并且有研究者发现在体内某种条件下HCECs可再次进入细胞周期，但是目前对于HCECs增殖仍尚待明确、可以促进HCECs增殖的神经生长因子等的机制仍未明晰。是否可以找到一种合适的细胞能够替代HCECs，一些再生的HCECs和正常的HCECs是否有差异等诸多问题仍需明确。加之，有关于HCECs再生的研究仅仅停留在体外培养或者动物实验阶段，距离临床应用仍有些差距。未来的研究重点应集中于应用组学技术从分子或基因水平揭晓HCECs增殖的机制，再通过特定的方式增强HCECs增殖的潜能，这样才能为HCECs失代偿患者带来希望。参考文献主体内容来源：中华眼科医学杂志预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇

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