数字PCR技术首次用于房水中微量病毒核酸

青光眼睫状体炎综合征，是一组以单眼发病、反复发作、伴有眼压升高以及少量灰白色角膜后沉着物为特征的眼科疾病，该病由Posner和Schlossman年最先报道,因此又被称为Posner-Schlossman综合征（PSS）[]。PSS是一种特殊类型的继发性青光眼，在我国较为常见，多发于青壮年（20-50岁），通常具有自限性（时间在两周左右）。患者会有轻度的非肉芽肿性睫状体炎，发作时患者眼压持续升高，控制眼压和减轻炎症反应是目前该病治疗的主要方式，此方法虽然能够缓解PSS急性发作，但并不能减少其复发，其发作会渐趋频繁，每次发作时间增长。由于对本病病因了解不清楚，治疗通常仅限于“治标”，有的患者通过药物无法控制眼压，需要滤过性手术治疗。此外，病情迁延反复最终可导致视网膜神经纤维层的丢失和视神经的萎缩(青光眼)，造成视力不可逆性损害[2,3]，因此临床上应该重视该病的认识，做好相关疾病的诊断和鉴别。目前PSS的发病机制尚不明确，病因假说主要有感染学说、过敏学说、血管源性学说、自身免疫和内分泌学说等，近年来越来越多的研究提示：PSS与人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和水痘带状疱疹病毒（VZV）等病毒感染有关[4-6]，为PSS有效治疗策略的改进提供了新方向。

针对不同病原，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫等引起的感染临床需要采取不容的治疗措施，因此病原的明确诊断对于后期的治疗至关重要。然而与传统的外周血样本相比，房水样本具有以下特点：（）取样量稀少通常不超过μL，难以满足多个项目的同时检测，（2）房水中病原核酸的含量更低，（3）前房穿刺过程具有一定的创伤性和意外风险，患者依从性相对较低，反复采样或动态采样患者通常难以接受。因此必须寻找一种高度灵敏、特异的检测方法，实现微量样本中痕量核酸的准确检测。房水中病原的检测主要通过Ig抗体检测和核酸检测两种途径实现，Ig抗体检测在灵敏度和特异性方面存在不足，虽然有研究表明经房水和血清白蛋白校正后的房水CMVIgG抗体校正比值，可一定程度提高房水中抗体检测的特异性[7]，但病原核酸PCR检测法可能在检测性能上表现出更大的优势。由于可以实现快速、灵敏检测，传统的PCR已被应用于葡萄膜炎患者房水中病原的检测[4-6,8]，但由于不同实验室PCR平台间缺少统一的检测执行标准，存在诸多差异（例如PCR试剂成分的不同，靶片段的不同等），导致同一份样本在不同的实验室进行检测，可能会得到明显不同的定性/定量报告[9-]，而检测报告结果的准确性直接影响临床疾病的诊断和治疗效果的判断，因此亟需寻找一种更加灵敏、准确的检测方法。微滴式数字PCR（ddPCR）是近年来新出现的技术，无需标准曲线即可实现样本中核酸的绝对定量，与传统的PCR相比，其检测体系抗干扰能力更强、检测结果更加灵敏和准确，特别适合珍贵房水样本中微量核酸的检测，具有良好的应用前景。

医院关明教授课题组与复旦大医院陈君毅教授课题组联合开展了一项针对PSS患者的前瞻性研究，本研究中共入组了30位患者（实验组组：60位PSS患者，对照组：70位老年白内障患者），患者的基本情况见表，本研究首次将ddPCR应用于PSS患者房水样本中病毒（HCMV、HSV、EBV和VZV）的检测，评价其在PSS诊断中的应用价值，并比较了ddPCR与经典的实时荧光定量PCR(qPCR)检测结果的一致性，对于检测结果不一致的样本再用NGS测序法进行验证。检测结果表明ddPCR法的灵敏度可达00copies/mL，检测出了27例HCMV阳性患者，而qPCR法的灵敏度仅为copies/mL，检测到了20例HCMV阳性患者，ddPCR法的检测结果与NGS法一致，两种方法均未检测到其它病毒。

图.HCMV阳性患者房水中病毒分布情况

图2.qPCR与dddPCR定量房水中HCMV浓度结果的比较

图3.NGS法确认房水中HCMV病毒的情况

图4.HCMV（+）的PSS患者典型临床特征示例

A：钱币样角膜后沉着物；B：虹膜脱色素

HCMV阳性患者房水中病毒分布情况见图，ddPCR法检测到的HCMV浓度的结果（Lg转化）显著高于qPCR法（.66±.92VS.±.6，P＜0.00，图2），与qPCR相比，ddPCR法的检测结果于患者临床症状具有更好的一致性，房水中HCMV病毒的NGS确认情况如图3所示，HCMV（+）的PSS患者典型临床特征示例如图4所示，所有ddPCR法HCMV阳性的患者进行抗病毒治疗，个月内即表现出前房炎症缓解、角膜水肿消退、高眼压得到良好控制（表2，表3）。

本研究的结果提示:HCMV可能是我国病毒性PSS的最主要致病因素，高达45%的PSS患者的房水样本中检出了HCMV，比例显著高于国内的相关报道[2]，未发现PSS患者房水中存在HSV、EBV和VZV。本研究发现ddPCR法比qPCR的检测结果更加灵敏、准确，更适合用于房水样本中微量病毒的检测，此外，ddPCR法的高灵敏度可以避免对患者进行重复穿刺取样，减少患者在被穿刺取样过程中的恐惧和痛苦。

目前本研究的成果发布于CLINEXPOPHTHALMOL杂志，医院检验医学科曹国医院檀宸博士为共同第一作者，医院检验医学科关医院陈君毅教授为共同通讯作者。

相关论文信息如下：

CaoGJ,TanC,ZhangYY,etal.DropletDigitalPCRAnalysisofCommonVirusesintheAqueousHumorofPatientswithPosner-SchlossmanSyndromeinChinesePopulation.CLINEXPOPHTHALMOL,.DOI:0./ceo..[Epubaheadofprint]

参考文献

[]POSNERA,SCHLOSSMANA.Syndromeofunilateralrecurrentattacksofglau